1-       شناور سازي (Flotation)

2-      رسوب گيري (Sedimentation)

اساس اين روش­ها آن است كه كيست­هاي تك ياخته­ها، اووسيست، تخم كرم­ها و لاروها از مواد اضافي موجود در مدفوع بوسيله عمل سانتريفوژ نمودن و با اساس تفاوت در وزن مخصوص جدا مي­گردد.

1-       روش استاندارد شناورسازي با سولفات روي (Zinc sulfate flotation) در روش شناور سازي، كيست­هاي تك ياخته و بعضي از تخم كرم­ها از مواد اضافي موجود در مدفوع، بر اساس استفاده از يك مايع با وزن مخصوص بالا، جدا مي­گردند. عناصر انگلي در سطح مايع مشاهده و مواد اضافي در ته لوله باقي مي­ماند. اين روش آسان­تر از روش رسوب گيري است، اما به هر حال بيشتر تخم كرم­ها مانند تخم­هاي دريچه دار و يا تخم­هاي خيلي سنگين مانند تخم آسكاريس غير بارور با اين روش تغليظ نمي­گردند.

بايد وزن مخصوص محلول سولفات روي در حد معيني باشد و نيز همه ارگانيسم­هايي كه در سطح مايع و در رسوب تجمع حاصل كرده­اند، جدا گرديده و تشخيص داده شوند. بايد نمونه در مدت 15 تا '20 بعد از مرحله سانتريفوژ نهايي بررسي شود، در غير اين صورت ارگانيسم شكل طبيعي خود را از دست داده و يا تخريب مي­گردد.

نمونه: بايد تازه باشد و يا در محلول نگهدارنده مانند فرمالين 5 يا 10 %  بافره و يا SAF = Sodium Acetate – Acetic Acid – Formalin نگهداري شده باشد.

 -           براي نمونه­هاي خيلي آبكي مرحله سانتريفوژ روش تغليظ را مي­توان حذف نمود.

مواد:

فرمالين 5 يا 10 % بافره يا SAF- سرم فيزيولوژي 0/85_g%، محلول سولفات روي (كحلول آبي 33)، حدود 330 گرم سولفات روي را با آب مقطر (به ميزان 670 ميلي ليتر) به حجم ليتر برسانيد.

وزن مخصوص محلول فوق بايد جهت نمونه­هاي نگهداري شده در فرمالين به ميزان 20/1 و براي نمونه­هاي تازه 18/1 باشد. در غير اين صورت بايد بوسيله اضافه نمودن سولفات روي و يا آب مقطر تنظيم گردد و در بطري­هاي در پيچ دار ذخيره گردد. تاريخ انقضاء را به مدت 36 ماه بعد از تاريخ ساخت بر روي بر چسب شيشه بنويسد و يا در صورتي كه وزن مخصوص از 02/0_± واحد تغيير كرده باشد، بايد محلول جديدي ساخته شود.

روش كار:

1-       حدود 4_g مدفوع تازه را داخل 10 ميلي ليتر فرمالين 10% (درون يك ظرف مناسب از نظر حجم نهايي) بريزيد. مدفوع و فرمالين را كاملاً مخلوط كنيد. مخلوط را به مدت حداقل 30 دقيقه جهت ثابت شدن نگه داريد. اگر نمونه در محلول نگهدارنده فرمالين و يا SAF نگهداري شده است. مخلوط ماده نگهدارنده و مدفوع را به خوبي مخلوط كنيد.

2-      نسبت به اندازه و قوام نمونه، تعداد كافي گاز مرطوب را روي هم قرار داده و ان را داخل يك قيف بگذاريد. قيف را داخل يك لوله ته مخروطي گذاشته و حدود 8 ميلي ليتر از مخلوط فوق را صاف نمائيد تا رسوبي به اندازه 5/0 تا 1 ميلي ليتر ايجاده كند. اگر نمونه در ماده نگهدارنده فرمالين و يا SAF قرار داده شده باشد، حدود 4-3 ميلي ليتر كافي است مگر اينكه نمونه مدفوع در ابتدا كم باشد.

3-      محلول سرم فيزيولوژي 85/0% را تا سر لوله اضافه كنيد و به مدت 10 دقيقه در دور 500_g سانتريفوژ نمائيد. مقدار رسوب به دست آمده بايد حدود 5/0 تا 1 ميلي ليتر باشد. رسوب خيلي غليظ و با خيلي رقيق نشان دهنده روش نادرست تغليظ است. (روش صحيح محاسبه تعداد دور در دقيقه بر اساس شعاع، كه در سانتريفوژهاي مختلف، متفاوت است در كتب مرجع موجود مي­باشد).

4-      مايع رويي را دور ريخته و رسوب را در 1 تا 2 ميلي ليتر سولفات روي به حالت سوسپانسيون در آوريد و سپس تا 3-2 ميلي ليتري لبه لوله را با محلول سولفات روي پر كنيد.

5-      به مدت يك دقيقه در دور 500_g سانتريفوژ كنيد. اجازه بدهيد كه بدون هچ دخالتي سانتريفوژ كاملاً متوقف شود. دو لايه تشكيل مي­گرددو مقدار كمي رسوب در ته لوله و يك لايه سولفات روي در بالاي لوله مشاهده مي­شود.

كيست تك ياخته­ها و بعضي از تخم كرم­ها در سطح و بعضي از تخم­هاي سنگين و يا دريچه دار در رسوب قرار مي­گيرند.

6-      بدون اينكه لوله را از سانتريفوژ خارج كنيد، يك يا دو قطره از سطح مايع را با كمك يك پي­پت پاستور و يا يك لوپ سيمي حرارت داده و سرد شده برداريد و روي يك لام بگذاريد.

هرگز لوپ را به طور عمقي وارد مايع نكنيدو بلكه فقط با سطح آن را به طريقي تماس دهيد كه لوپ موازي با سطح مايع قرار گيرد (نه اينكه با آن سطح با آن زاويه °90 بسازد). مطوئن باشيد كه نوك پي­پت يا لوپ زير سطح مايع وارد نشود.

7-      يك لامل 22×22 و يا 24×22 ميلي متر روي آن قرار دهيد. جهت آماده سازي نمونه از محلول لوگل مي­توان استفاده نمود.

8-      با عدسي با بزرگ نمايي (10×) تمام سطح لامل را بررسي كنيد.

9-      اگر مورد مشكوكي مشاهده گرديد، با بزرگ نمايي (40×) براي مطالعه جزئيات بيشتر استفاده نمائيد. بايد حداقل 3/1 سطح لامل را بررسي كنيد، حتي اگر مورد مشكوكي مشاهده نگرديد.

10-    قبل از آزمايش و يا بعد از آن مي­توان لام مرطوب را جهت آموزش به ديگران در يك پليت محتوي كاغذ مرطوب در روي يك اپليكاتور و يا پايه مخصوص لام قرار دهيد. هواي محفظه بايد كاملاً مرطوب باشد اما خيس نباشد.

گزارش نتايج: مثال­هايي از گزارش مثبت شامل:

Giardia lamblia cysts present.

Trichuris Trichiura eggs present.

Few macrophages present.

Moderate WBCs present.

مي­باشد.

نكات قابل توجه در روش:

 -     استفاده از آب لوله كشي مي­تواند جايگزين استفاده از سرم فيزيولوژي گردد. بعضي از كاركنان ترجيح مي­دهند كه در تمام مراحل روش به جاي آب، محلول فرمالين 5%  يا 10% استفاده كنند.

 -     اگر نمونه­ها در SAF نگهداري شده اند، آزمايش از مرحله 2 شروع مي­شود.

 -     اگر در مورد نمونه­هاي تازه از آب لوله كشي استفاده شود، ممكن است انگل بلاستوسيستيس هومينيس از بين برود.

 -     اگر ترجيح مي­دهيد كه جهت نمونه برداري لوله­ها را از سانتريفوژ خارج نمائيد، دقت كنيد كه قبل از نمونه برداري مايع تكان نخورد.

 -     بعضي از كاركنان ترجيج مي­دهند كه مقدار كمي سولفات روي را به سطح لوله اضافه كرده، به نحوي كه سطح مايع يك برآمدگي كوچك محدب شكل را تشكيل دهد و سپس يك لامل بر روي سطح آن قرار دهند. بايد '5 صبر نموده و در اين مدت لوله را تكان ندهيد، سپس لامل را با دقت از روي لوله برداشته و جهت بررسي روي يك لام قرار دهيد. محدوديت­هاي روش: تك ياخته­هاي مشاهده شده در نمونه بايد بوسيله روش رنگ آميزي دائمي تائيد شوند. بعضي از تك ياخته­ها كوچك بوده و تشخيص آنها با اين مشكل مي­باشد.

بايد حداكثر در فاصله زماني 5 دقيقه بعد از توقف كامل سانتريفوژ، سطح مايع جهت بررسي، برداشت گردد چون هر چه تماس ارگانيسم­ها با محلول سولفات روي بيشتر شود، امكان اينكه شكل طبيعي خود را از دست دهند، بيشتر مي­باشد، به طوري كه اگر كيست پروتوزوئرها و تخم كرم­هاي داراي ديواره ضخيم بيشتر از چند دقيقه در تماس با محلول سولفات روي با وزن مخصوص بالا قرار بگيرد، ممكن است متلاشي شده و يا شكل طبيعي خود را از دست بدهد.

اگر از روش شناور سازي، به عنوان تنها روش تشخيصي استفاده مي­كنيد، بايد سطح مايع و هم رسوب آن را بررسي كنيد تا مطمئن شويد كه همه ارگانيسم­ها را جدا نموده و تشخيص مي­دهيد. به هر حال روش تغليظ فرمالين- اتيل استات (اتر) لازم به بهترين روش جهت جداسازي و تشخيص تخم كرم­ها، كيست، تك ياخته­ها و .... مي­باشد.

روش استاندارد رسوب سازي (Sedimentation Standard Methods)

روش استاندارد فرمالين – اتيل استات (اتر)

جهت جدا سازي همه انواع تك ياخته­ها، اووسيست­ها، تخم كرم­ها لاروها مناسب مي­باشد. در اين روش ارگانيسم­هاي سنگين­تر در مقايسه با عناصر سبك­تر محلول زوردتر ته نشين مي­شود و علاوه بر مراحل سانتريفوژ، مراحل صاف كردن از بين بردن چربي را شامل مي­گردد. در مرحله صاف كردن قطعات بزرگ و مواد اضافي مدفوع به وسيله صاف كردن از طريق چند لايه گار مرطوب گرفته مي­شوند.

تركيبات از بين برنده شامل اتر، اتيل استات، Hemo  - De  و يا تركيبات گزيلن (Xylene) مي­باشد كه چربي­هاي مدفوع را حل كرده و مواد اضافي را شناور مي­سازد، اما به تخم كرم­ها، لاروها و يا كيست پروتوزوئرها آسيبي نمي­رساند. معمولاً در اين روش تروفوزوئيت تك ياخته­ها خراب شده و يا از بين مي­رود.

مناسب­ترين روش تغليظ استفاده از اتيل استات و تركيبات ديگر مانند Hemo – De به جاي اتر است كه علت آن حفظ سلامتي افراد مي­باشد. اين تركيبات دقيقاً همان عمل اتر را انجام مي­دهند.

روش­هاي تغليظ را مي­توان روي نمونه­هاي نگهداري شده در Polyvinyl Alcohol = PVA انجام داد، اما ممكن است در مرحله از بين بردن چربي، بعضي از ارگانيسم­ها به خصوص پروتوزوئرها خراب شوند. بنابراين همان طور كه در جزوه قبلي ذكر گرديد بهتر است كه عمل تغليظ را روي نمونه­هاي نگهداري شده در فرمالين و عمل رنگ آميزي را روي نمونه­هاي نگهداري شده در PVA انجام داد.

براي نمونه­هاي آبكي بايد استفاده از يك مرحله سانتريفوژ (10 دقيقه در دور 500_g) جايگزين روش تغليظ معمولي گردد. (روش صحيح محاسبه تعداد دور در دقيقه بر اساس شعاع كه در سانتريفوژهاي مختلف، متفاوت است، در كتب مرجع موجود مي­باشد).

مواد و معرف­هاي لازم:

1-       مواد از بين برنده چربي مانند اتيل استات و ......

2-      فرمالين 5 يا 10 درصد بافر شده و يا Sodium Acetate – Acetic Acid – Formalin = SAF

3-      Nacl 85/0 %

4-      محلول لوگل

روش كار:

1-       حدود 4 گرم از مدفوع تازه را داخل 10 ميلي ليتر فرمالين 10% (در يك ظرف مناسب از نظر حجم نهايي) مخلوط كرده و اجازه دهيد كه جهت ثابت شدن عناصر انگلي موجود در مخلوط، به مدت 30 دقيقه بماند اگر نمونه در محلول نگدارنده مانند فرمالين 5 يا 10 درصد و يا SAF گرديده است، آن را كاملاً مخلوط كنيد.

2-      در رابطه با مقدار و قوام مدفوع، تعداد كافي گاز مرطوب را روي هم قرار داده و سپس آن را داخل قيف بگذاريد. قيف را داخل يك لوله ته مخروطي 10 ميلي ليتري و يا لوله­هاي مخصوص ساتريفوژ قرار دهيد. شكل ته لوله بايد به نحوي باشد كه مقدار كافي رسوب (0.5ml – 1ml) ايجاد كند. معمولاً 8 ميلي ليتر فرمالين و مدفوع آماده شده صاف مي­گردد. اگر نمونه در ماده نگهدارنده فرمالين يا SAF نگهداري شده است، حدود 3 ميلي ليتر از آن كافي است مگر اينكه نمونه حاوي مقدار خيلي كمي مدفوع باشد.

3-      محلول سرم فيزيولوژي را تا نوك لوله اضافه منيد و به مدت 10 دقيقه در دور 500_g سانتريفوژ نمائيد.

به نقل از: